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dapi染色原理新上映_什么情况病理特殊染色(2024年12月抢先看)

内容来源：飘花网电影所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

dapi染色原理

Annexin V-PI染色，测凋亡！细胞凋亡是生物学中一个复杂但至关重要的过程，它涉及多种分子和染色方法。其中，Annexin V-PI染色是一种相对简单的双染方法，用于检测细胞凋亡。让我们深入了解一下这种方法的工作原理和操作步骤。 𐟔 细胞凋亡的标志细胞凋亡过程中，细胞核会变形、浓缩、碎裂，这可以通过Hoechst染色或DAPi染色来观察。此外，细胞膜也会发生变化，部分膜会包裹细胞内容物形成凋亡小体，这可以通过电子显微镜观察到。还有一种变化是细胞膜破损外翻，这可以用标记细胞膜内侧的染料来检测，配合检测细胞核内物质的染料进行双染，判断细胞凋亡的进程。 𐟒᠁nnexin V-PI染色的原理 Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能够特异性结合凋亡细胞膜外层的磷脂酰丝氨酸。正常细胞的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜磷脂双分子层的内层，而凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸则位于外层。因此，Annexin V可以通过钙依赖的方式结合凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸。 𐟧ꠦ“作流程制备细胞悬液：用不含EDTA的胰酶消化细胞，制备细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清。洗细胞：用PBS洗一次，再用1x binding buffer洗一次。调整细胞浓度：使用1x binding buffer将细胞浓度调整为1-5x10^6/ml。 Annexin V染色：取100ul细胞悬液，加入5ul荧光标记的Annexin V，室温避光孵育10-15分钟。洗细胞：用1x binding buffer洗一次，200rpm离心5分钟，200ul 1x binding buffer重悬细胞。 PI染色：加入5ul PI，混匀。流式测定：使用专用软件分析流式数据，得到凋亡细胞比例。 𐟓Š 数据处理与绘图定量分析：使用专用软件分析流式数据（可以使用flowJo），得到凋亡细胞比例。将3次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。读图指南：在Annexin V-PI染色中，PI+细胞碎片代表晚期凋亡细胞，Annexin V+ PI-代表早期凋亡细胞，Annexin V+ PI+代表正常细胞。 𐟔젥𞋥ˆ†析例如，Jurkat细胞在经过抗Fas抗体处理后，可以通过Annexin V-PI染色来检测细胞的凋亡情况。通过对比不同处理条件下的细胞染色结果，可以定量分析细胞的凋亡比例。 𐟓Œ 小贴士在进行Annexin V-PI染色时，建议多加一组未染色的组，以便于寻找目标细胞群。在实验设计时，可以考虑添加阴性对照和空白对照，以增加实验的可信度。通过这些步骤和技巧，你可以精确地检测到细胞的凋亡情况，为生物学研究和药物开发提供有力支持。

流式细胞术检测细胞周期全攻略细胞周期是指从细胞分裂产生的新细胞生长开始，到下一次细胞分裂形成子细胞结束的过程。这个过程主要分为Go、G1、S、G2和M期，其中M期又分为前期、中期、后期及末期。Go期是细胞休眠期，暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定的生物学功能。 𐟌€ 流式检测细胞周期的基本原理流式检测细胞周期的常用方法是检测DNA的含量。通过选择能与DNA结合的荧光染料，根据细胞各个时期DNA含量不同从而荧光强度不同的方法，检测出细胞周期。常用的染料有PI、7AAD、DAPI、Hoechst33258和DRAQ7等。 𐟔砦“作步骤离心收集细胞，预冷PBS洗细胞2次。将细胞悬液滴入预冷的70%乙醇中，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。离心收集细胞，PBS洗细胞1次。加入500ul稀释后PI染液（含1mg/mlPI，2mg/mlRNaseA），室温避光孵育30min。流式细胞仪检测：细胞计数2-3万个。使用Flowjo分析结果。 𐟚蠦𓨦„事项进样速度需要控制在低速以下，否则结果中可能没有S期存在。 PI染料具有细胞毒性，需在1小时内上机检测。 PI染料与DNA结合松散，洗涤可能会造成染料丢失。除非染色结果异常，无需洗涤。使用预冷乙醇固定时，向内加入细胞时，如果产生大量絮状物，说明细胞状态差，胞内DNA释放缠绕细胞，造成团块，需重新制备样品。 PI可与RNA结合，因此在染色时需加入RNA酶去除胞内RNA。 𐟓Š 数据分析 Flowjo分析结果时，需要注意CV值（变异系数），一般CV值越小，峰型越好，越尖锐。G2/G1的比值一般为1.8-2.0之间，若小于1.8，则细胞染色不充分。通过以上步骤和注意事项，可以准确地进行流式检测细胞周期的实验，并得到可靠的结果。

小鼠脑片冰冻切片免疫荧光染色全攻略嘿，大家好！今天我们来聊聊如何用小鼠脑片做冰冻切片免疫荧光染色。这个过程其实有点复杂，但只要掌握了步骤，还是挺有趣的。让我们一起来看看吧！准备工作 𐟧ꊩ斥…ˆ，你需要准备好以下材料： 6孔板 PBS溶液封闭液一抗和二抗 DAPI染色液 Ant-FADE封片剂步骤一：漂洗 𐟌Š 把切好的脑片放入6孔板中，加入适量的PBS溶液，用毛笔轻轻搅拌，漂洗三次，每次5-10分钟。这个步骤很重要，可以去除脑片上的杂质。步骤二：封闭 𐟔’ 接下来，把封闭液加入6孔板中，把漂洗好的切片放进去，室温下孵育40-60分钟。如果你做的是细胞膜上表达的抗原，可以先用0.5%的Triton X-100通透15分钟，然后用1㗐BST浸洗三次，每次3分钟。再用正常山羊血清封闭液封闭30分钟。步骤三：孵育一抗 𐟐 把一抗按说明书比例稀释在抗体稀释液中，然后在1.5ml的EP管中加入200-500微升的稀释好的抗体溶液。挑入1-15张脑片进行一抗孵育，4℃孵育过夜（或者48-72小时）。步骤四：洗涤 𐟚🊦ŠŠ孵育好一抗的脑片挑入加好PBS溶液的6孔板中洗涤三次，每次5-10分钟。如果成像的脑片有许多杂质无法洗净，可以用PBST代替PBS作为洗涤液。步骤五：孵育二抗 𐟐 把二抗按说明书比例稀释在抗体稀释液中，在孔板或1.5ml管中孵育二抗，然后把脑片挑入其中，室温孵育2小时，注意避光孵育（用锡纸避光）。步骤六：再次洗涤 𐟚🊦ŠŠ孵育好二抗的脑片挑入加好PBS溶液的6孔板中洗涤三次，每次5-10分钟。如果杂质还是很多，可以用PBST代替PBS作为洗涤液。步骤七：爬片 𐟧—‍♂️ 用毛笔轻轻把脑片扒至载玻片上，稍微晾干后进行DAPI染色，再滴加Ant-FADE封裱剂防止荧光淬灭，最后用荧光显微镜观察。你也可以使用DAPI封片剂一体的商品化溶液，方便快捷。小结 𐟓 这就是小鼠脑片冰冻切片免疫荧光染色的全部步骤啦！希望这篇攻略能帮到你们。如果有任何问题，欢迎在评论区留言哦！参考文献： Wu, S., Ren, X., Zhu, C. et al. A c-Fos activation map in nitroglycerin/levcromakalim-induced models of migraine. J Headache Pain 23, 128 (2022).

浙大读博日常：细胞骨架免疫荧光初体验最近在浙大读博，终于鼓起勇气尝试了一下细胞骨架染色，用的是鬼笔环肽来标记微丝。虽然第一次做，但效果还不错，至少能清楚看到微丝的存在，真是让人开心得不得了。为了拍这些照片，我可是花了四个小时在共聚焦显微镜下，真是要看吐了。不过，老板花了五百大洋，值了！ 𐟓 实验步骤如下：固定细胞：用4%多聚甲醛室温下固定20分钟。破膜处理：加入0.1%的Triton X-100，室温下处理5分钟。封闭：用BSA封闭液室温下封闭0.5到1小时。一抗孵育：用OPN抗体，4℃过夜孵育。二抗染色：用AF488标记的二抗，室温下处理1小时。 Actin染色：用Tracker Red 555微丝荧光探针染色。 DAPI染色：用DAPI染料室温下处理10分钟。封片：用抗荧光淬灭封片剂（5ul）和指甲油封片。保存：用锡箔纸包好，4℃保存。有个小疑问，为什么细胞核有的大有的小？那些小小的细胞核是不是也是BMSC？还是说原代培养中混入了其他细胞？或者是还没长开的年幼BMSC？又或者是已经成骨分化的成骨细胞？顺便问一下，有没有好用的DAPI推荐？我这次用的DAPI染了十分钟，拍的时候电压调到180还要降背景才能拍出这种效果，真是累得不行。

细胞染色全攻略：从零开始到实验结果细胞染色其实并不复杂，只要按照步骤来，你也能轻松搞定。今天我就来分享一下我们在实验室常用的细胞染色方法和操作步骤，希望对大家有帮助。准备工作 𐟧ꊩ斥…ˆ，你需要消化并收集细胞，然后以2-10㗱0Ⳡcell/coverslip的密度接种到24孔板中。滴加50-100⵬的细胞悬液，2小时后补加500⵬的10%FBS+DMEM。培养细胞 𐟌𑊥𐆲4孔板放入37℃的细胞培养箱中培养48小时，然后用显微镜观察。选择细胞状态和数量都合适的玻片进行染色。固定细胞 𐟔犥Ž𛦎‰旧的培养液，用冰冷的PBS洗两次。然后加入0.5ml的3.7-4%甲醛（在PBS中），室温固定10分钟。穿膜处理 𐟌Š 再用PBS洗两次，加入0.5ml的穿膜液（0.1% triton X-100 + 0.1M Gycine），冰上放置30分钟。封闭非特异性结合 𐟛᯸ 再次用PBS洗两次，加入0.3ml的5mg/ml BSA，室温封闭1小时。一抗孵育 𐟐𐊧”萂S洗两次，取一张封口膜，标记好，加入25⵬的一抗（用5mg/ml BSA稀释1：50-100）。将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时。然后小心夹起盖玻片，细胞面朝上放入原来的24孔板中，再用PBS洗两次。二抗孵育 𐟐‘ 取另一张封口膜，标记好，加入25⵬的二抗（羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）。将盖玻片细胞面朝下反扣在二抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时。 DAPI染色 𐟒™ 用PBS洗两次，将玻片与10⵬的DAPI（1ⵧ/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O）室温孵育1-5分钟。封片与观察 𐟔슧”萂S洗三次，擦干玻片背面的水分，封片于载玻片上，标记好（时间、细胞名称、实验内容、号码）。待封片胶干后，可以在荧光显微镜下观察。观察时注意记录每张玻片的内容，以免混淆。观察完后将玻片放-20℃保存。简化操作 ⚡ 如果你只观察转染了EYFP的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可以直接用DAPI染核后封片。为了保证实验的重复性，每次最好做平行2组以上。对照组设置 𐟧ꊤ𛥂SA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。希望这些步骤能帮到你，让你的细胞染色实验更加顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

𐟧즗 水乙醇处理酵母需灭菌吗？ 𐟤”你是否在实验中遇到过需要使用无水乙醇处理酵母的情况？在dapi染色酵母的实验步骤中，有一环节要求用100%乙醇处理酵母30分钟，而protocol推荐使用sigma的100%乙醇。𐟤𗢀♀️那么，如果实验室没有sigma的乙醇，使用普通无水乙醇会有什么影响呢？是否需要过滤除菌呢？ 𐟔首先，我们要明确，无水乙醇本身就是一种灭菌剂，其浓度为100%，能有效杀灭大部分微生物。然而，在实验室操作中，为了确保实验结果的准确性和安全性，使用前最好进行过滤除菌处理。 𐟒᥻𚨮š在处理酵母时，如果实验室条件允许，最好使用sigma或其他信誉良好的品牌的100%乙醇。如果无法获取，也可使用实验室普通无水乙醇，但务必确保在使用前进行过滤除菌处理。 𐟔奮‰全提示：在处理乙醇时，请务必遵守实验室安全规范，避免使用易产生火花的工具，并确保在干燥、通风的环境中进行操作。如有任何不适，请立即就医。 𐟒ᥰ贴士：实验过程中，请务必做好个人防护，佩戴好实验室防护用品，如手套、口罩等。同时，为了确保实验数据的准确性，建议重复实验并记录详细数据。

𐟧Š𐟒᥆𐥈‡免疫荧光小白全攻略✨ 𐟔 想要掌握冰切免疫荧光技术？看这里就够了！ 𐟌Ÿ 关键点速览： 1️⃣ 小鼠心脏灌注要彻底，避免非特异信号哦！ 2️⃣ 破膜封闭要梯度尝试，找到最适合你的破膜液和血清浓度。 3️⃣ 一抗选择很关键，建议多翻文献，选最优公司。 4️⃣ 漂洗要充分，让片子在溶液中“舞动”起来。 𐟓 详细步骤来啦： 1️⃣ 复温：冰冻切片先放冰箱外半小时，让它暖暖身子。 2️⃣ 漂洗：轻轻洗去切片上的杂质。 3️⃣ 破膜封闭：根据目的蛋白位置决定，膜上可直接封，胞内建议破膜10-15min。 4️⃣ 一抗：4度冰箱放16-20小时，让抗体充分结合。 5️⃣ 复温：再放20-30分钟，让抗体更稳定。 6️⃣ 漂洗：再次清洗切片。 7️⃣ 二抗：室温放1.5小时，让二抗与一抗结合。 8️⃣ 漂洗：再次清洁切片。 9️⃣ DAPI染色：给细胞核染色，更清晰观察。 𐟔Ÿ 封片：最后一步，让切片更美观。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚥ꌨ€—材要新鲜哦，这样才能事半功倍！ 𐟎‰ 现在你已经是冰切免疫荧光小达人啦！快去试试吧！

如何选择适合你的研究级显微镜？𐟔 显微镜是生命科学研究的核心设备，尤其在探索各种科学问题时发挥着重要作用。选择合适的研究级显微镜需要考虑多个因素，包括标本类型、对比方法、光源以及是否需要数字化记录结果。以下是一些关键点，帮助你做出明智的选择。 𐟔 标本类型选择显微镜时，首先要考虑你的标本类型。例如，固定在玻璃片上的组织切片适合使用正置显微镜，而活细胞则需要倒置显微镜，因为活细胞通常生长在培养皿中。 𐟌ˆ 对比方法大多数细胞是透明的，对比度低，难以观察。因此，需要使用各种对比增强方法来观察。例如，相差对比和微分干涉对比可以增加细胞的对比度，而荧光染料如DAPI则可以染色后观察。 𐟒ᠥ…‰源选择不同的对比方法需要不同的光源。常规明场显微镜可以使用卤素灯或LED照明，而荧光观察则需要更宽光谱的荧光光源，如LED荧光光源、汞灯、氙灯或卤素灯。LED荧光光源因其寿命长和方便易用而成为现代主流选择。 𐟓𘠦•𐥭—化记录如果你需要进行活细胞成像，特别是荧光活细胞成像，建议选择带有灵敏相机的数码显微镜。这样可以尽量减少激发光对细胞的损害。例如，高性能的sCMOS相机结合直观的软件系统，可以快速启动并获取数据。 𐟛 ️ 易于使用一个易于使用的显微镜系统可以大大简化操作流程。直观的软件界面和集成的软硬件系统可以帮助用户快速上手并获得数据。通过考虑这些因素，你可以选择到最适合你的研究级显微镜，从而更好地进行科学探索。

免疫荧光避串色，实战心得！做过免疫荧光的小伙伴们肯定都知道，避免串色可是个技术活儿。今天就来聊聊如何有效避免串色，分享一些实用的技巧和心得。 Protocol详解 𐟓œ 首先，大家可以参考图2的文字部分，那里有详细的protocol。记住，细节决定成败哦！如何有效避免串色？ 𐟤” 铺细胞别太密，用大体积细胞更好细胞密度太大，一抗结合的蛋白也会增多，非特异性染色就容易出现。一般来说，6孔板满孔的细胞我会取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。用大体积细胞（例如HeLa）拍摄效果更好，HEK细胞相对来说效果欠佳。核染色放在最后双抗体染色时，不用一开始就染核液（Hoechst），放到最后封片时再用DAPI染。DAPI浓度不要过高，核很容易被染色，低浓度染色即可。支原体清除后再做IF 用状态好、未被污染的细胞去做IF，效果会更好。如果细胞被支原体污染，可能会产生严重的非特异性染色，染核和染抗体都会被染上乱七八糟的东西。一抗浓度要合适双抗体染色时，如果外转质粒，可以染标签抗体，标签抗体更特异且使用浓度低，一般都在1:500左右。如果染内源性蛋白，浓度可以1:200。记得查看抗体说明书，确认该抗体是否可以做IF。4度过夜染色效果更好，一抗可以回收，负20保存，大概可用3次，根据抗体灵敏度决定使用次数。双抗体IF一定要用不同抗性的抗体，一个用鼠，一个用兔，最好不要双鼠或双兔。二抗处理要小心常温孵育1～2小时，避光，避开同属性的二抗。洗一抗可以用PBS，二抗可以用TBST，多加一些吐温。拍摄技巧 𐟓𘊥𐁧‰‡后拍摄时，可以适当缩短激发光波长，使其没有交叉波长。比较好的选择是绿光488和红光555。希望这些小技巧能帮到大家，避免串色其实并不难，只要注意细节，多实践就能掌握啦！

细胞骨架染色全攻略：从实验到结果细胞鬼笔环肽染色是一种非常重要的实验技术，用于观察和研究细胞骨架中微丝（主要由肌动蛋白组成）的分布。通过这种染色方法，研究者可以直观地了解细胞骨架的结构和动态变化，这对理解细胞的运动、形态维持和细胞分裂等过程至关重要。实验步骤详解样本准备：使用细胞爬片技术，在培养皿中让细胞贴壁生长，形成单层细胞。细胞固定：用PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞3次，每次5分钟，以去除培养基和其他杂质。然后，用4%多聚甲醛溶液室温固定细胞20分钟，这一步骤的目的是使细胞内的蛋白质保持其天然形态，防止在后续处理过程中发生变形或降解。清洗：再次用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，以去除多聚甲醛残留。鬼笔环肽染色：取适量（如200）配置好的FITC（荧光素异硫氰酸酯）标记的鬼笔环肽工作液，覆盖在铺满细胞的爬片上。室温孵育30-60分钟，让鬼笔环肽充分结合到纤维状肌动蛋白上。再次清洗：用PBS清洗玻片3次，每次10分钟，以去除未结合的鬼笔环肽。细胞核染色：使用200 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色液对细胞核进行染色，染色时间通常为10分钟。DAPI能够穿透细胞膜与细胞核中的DNA结合，发出蓝色荧光。最终清洗与封片：再次用PBS清洗3次，每次10分钟，以去除DAPI残留。吸去多余水分，加上荧光封片液，以防止荧光淬灭，并盖上盖玻片。观察与拍照：在荧光显微镜下观察染色结果，并拍摄照片。FITC标记的鬼笔环肽会发出绿色荧光，显示微丝在细胞中的分布；DAPI则发出蓝色荧光，标记细胞核的位置。染色示例通过细胞鬼笔环肽染色，研究者可以看到细胞骨架中微丝形成的网络结构，这些微丝在细胞内呈现出复杂的交织形态，对维持细胞形态、参与细胞运动等过程起着重要作用。同时，结合DAPI染色显示的细胞核位置，可以进一步分析微丝与细胞核之间的空间关系，为深入研究细胞骨架的功能提供重要线索。

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