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dapi染色原理新上映_dab染色原理作用nbt(2024年11月抢先看)

内容来源：飘花网电影所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

dapi染色原理

细胞染色全攻略：从零开始到实验结果细胞染色其实并不复杂，只要按照步骤来，你也能轻松搞定。今天我就来分享一下我们在实验室常用的细胞染色方法和操作步骤，希望对大家有帮助。准备工作 𐟧ꊩ斥…ˆ，你需要消化并收集细胞，然后以2-10㗱0Ⳡcell/coverslip的密度接种到24孔板中。滴加50-100⵬的细胞悬液，2小时后补加500⵬的10%FBS+DMEM。培养细胞 𐟌𑊥𐆲4孔板放入37℃的细胞培养箱中培养48小时，然后用显微镜观察。选择细胞状态和数量都合适的玻片进行染色。固定细胞 𐟔犥Ž𛦎‰旧的培养液，用冰冷的PBS洗两次。然后加入0.5ml的3.7-4%甲醛（在PBS中），室温固定10分钟。穿膜处理 𐟌Š 再用PBS洗两次，加入0.5ml的穿膜液（0.1% triton X-100 + 0.1M Gycine），冰上放置30分钟。封闭非特异性结合 𐟛᯸ 再次用PBS洗两次，加入0.3ml的5mg/ml BSA，室温封闭1小时。一抗孵育 𐟐𐊧”萂S洗两次，取一张封口膜，标记好，加入25⵬的一抗（用5mg/ml BSA稀释1：50-100）。将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时。然后小心夹起盖玻片，细胞面朝上放入原来的24孔板中，再用PBS洗两次。二抗孵育 𐟐‘ 取另一张封口膜，标记好，加入25⵬的二抗（羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）。将盖玻片细胞面朝下反扣在二抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时。 DAPI染色 𐟒™ 用PBS洗两次，将玻片与10⵬的DAPI（1ⵧ/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O）室温孵育1-5分钟。封片与观察 𐟔슧”萂S洗三次，擦干玻片背面的水分，封片于载玻片上，标记好（时间、细胞名称、实验内容、号码）。待封片胶干后，可以在荧光显微镜下观察。观察时注意记录每张玻片的内容，以免混淆。观察完后将玻片放-20℃保存。简化操作 ⚡ 如果你只观察转染了EYFP的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可以直接用DAPI染核后封片。为了保证实验的重复性，每次最好做平行2组以上。对照组设置 𐟧ꊤ𛥂SA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。希望这些步骤能帮到你，让你的细胞染色实验更加顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

𐟧즗 水乙醇处理酵母需灭菌吗？ 𐟤”你是否在实验中遇到过需要使用无水乙醇处理酵母的情况？在dapi染色酵母的实验步骤中，有一环节要求用100%乙醇处理酵母30分钟，而protocol推荐使用sigma的100%乙醇。𐟤𗢀♀️那么，如果实验室没有sigma的乙醇，使用普通无水乙醇会有什么影响呢？是否需要过滤除菌呢？ 𐟔首先，我们要明确，无水乙醇本身就是一种灭菌剂，其浓度为100%，能有效杀灭大部分微生物。然而，在实验室操作中，为了确保实验结果的准确性和安全性，使用前最好进行过滤除菌处理。 𐟒᥻𚨮š在处理酵母时，如果实验室条件允许，最好使用sigma或其他信誉良好的品牌的100%乙醇。如果无法获取，也可使用实验室普通无水乙醇，但务必确保在使用前进行过滤除菌处理。 𐟔奮‰全提示：在处理乙醇时，请务必遵守实验室安全规范，避免使用易产生火花的工具，并确保在干燥、通风的环境中进行操作。如有任何不适，请立即就医。 𐟒ᥰ贴士：实验过程中，请务必做好个人防护，佩戴好实验室防护用品，如手套、口罩等。同时，为了确保实验数据的准确性，建议重复实验并记录详细数据。

免疫荧光避串色，实战心得！做过免疫荧光的小伙伴们肯定都知道，避免串色可是个技术活儿。今天就来聊聊如何有效避免串色，分享一些实用的技巧和心得。 Protocol详解 𐟓œ 首先，大家可以参考图2的文字部分，那里有详细的protocol。记住，细节决定成败哦！如何有效避免串色？ 𐟤” 铺细胞别太密，用大体积细胞更好细胞密度太大，一抗结合的蛋白也会增多，非特异性染色就容易出现。一般来说，6孔板满孔的细胞我会取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。用大体积细胞（例如HeLa）拍摄效果更好，HEK细胞相对来说效果欠佳。核染色放在最后双抗体染色时，不用一开始就染核液（Hoechst），放到最后封片时再用DAPI染。DAPI浓度不要过高，核很容易被染色，低浓度染色即可。支原体清除后再做IF 用状态好、未被污染的细胞去做IF，效果会更好。如果细胞被支原体污染，可能会产生严重的非特异性染色，染核和染抗体都会被染上乱七八糟的东西。一抗浓度要合适双抗体染色时，如果外转质粒，可以染标签抗体，标签抗体更特异且使用浓度低，一般都在1:500左右。如果染内源性蛋白，浓度可以1:200。记得查看抗体说明书，确认该抗体是否可以做IF。4度过夜染色效果更好，一抗可以回收，负20保存，大概可用3次，根据抗体灵敏度决定使用次数。双抗体IF一定要用不同抗性的抗体，一个用鼠，一个用兔，最好不要双鼠或双兔。二抗处理要小心常温孵育1～2小时，避光，避开同属性的二抗。洗一抗可以用PBS，二抗可以用TBST，多加一些吐温。拍摄技巧 𐟓𘊥𐁧‰‡后拍摄时，可以适当缩短激发光波长，使其没有交叉波长。比较好的选择是绿光488和红光555。希望这些小技巧能帮到大家，避免串色其实并不难，只要注意细节，多实践就能掌握啦！

𐟧Š𐟒᥆𐥈‡免疫荧光小白全攻略✨ 𐟔 想要掌握冰切免疫荧光技术？看这里就够了！ 𐟌Ÿ 关键点速览： 1️⃣ 小鼠心脏灌注要彻底，避免非特异信号哦！ 2️⃣ 破膜封闭要梯度尝试，找到最适合你的破膜液和血清浓度。 3️⃣ 一抗选择很关键，建议多翻文献，选最优公司。 4️⃣ 漂洗要充分，让片子在溶液中“舞动”起来。 𐟓 详细步骤来啦： 1️⃣ 复温：冰冻切片先放冰箱外半小时，让它暖暖身子。 2️⃣ 漂洗：轻轻洗去切片上的杂质。 3️⃣ 破膜封闭：根据目的蛋白位置决定，膜上可直接封，胞内建议破膜10-15min。 4️⃣ 一抗：4度冰箱放16-20小时，让抗体充分结合。 5️⃣ 复温：再放20-30分钟，让抗体更稳定。 6️⃣ 漂洗：再次清洗切片。 7️⃣ 二抗：室温放1.5小时，让二抗与一抗结合。 8️⃣ 漂洗：再次清洁切片。 9️⃣ DAPI染色：给细胞核染色，更清晰观察。 𐟔Ÿ 封片：最后一步，让切片更美观。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚥ꌨ€—材要新鲜哦，这样才能事半功倍！ 𐟎‰ 现在你已经是冰切免疫荧光小达人啦！快去试试吧！

共聚焦显微镜使用指南：防忘版嘿，大家好！今天我想跟大家分享一下如何使用共聚焦显微镜。作为一个实验室小白，我深知忘记步骤的痛苦，所以特地整理了一份防忘版的使用指南，希望能帮到大家。预约实验室时间 𐟓… 首先，记得提前预约公共实验室的时间。这样你就可以确保你有足够的时间进行实验，避免和其他人抢时间。开机步骤 𐟔犨🛥…奮ž验室后，按照以下步骤打开设备：从左到右依次按下按钮。扭动钥匙，打开激光。打开电脑上的软件，按照图示进行设置。观察样品 𐟔 接下来，观察DAPI染色的烟草。正面朝上盖上盖薄片，然后盖薄片朝下对着物镜。如果你需要观察免疫荧光制片，记得在镜头上加油。观察模式 𐟌ˆ 在软件中，你可以选择不同的观察模式： BF➕IL-shutter：明场观察。 FLUO➕DAPI：观察蓝色荧光（细胞核）。 FITC：观察绿色免疫荧光。 TXR：观察红色。保存文件 𐟒𞊥𝓤𝠥ˆ实验后，记得保存文件。点击停止live，然后点击start进行拍照。保存到电脑本地文档后，打开浏览器，登录云端账号（密码在桌面文档），将文件上传到云端。结果解读 𐟧슧𛿨‰𒨍祅‰通常表示载体表达的蛋白和荧光融合蛋白。绿色GFP和蓝色DAPI重合说明蛋白进入了细胞核。荧光二抗显示红色，比如一抗是h3k9me抗体，那么红色表示细胞核中组蛋白具有h3k3me，红色亮度大小可以表示甲基化程度。如果载体转入的是去甲基化酶，空载为绿蓝红都亮，表示具有甲基化。带有蛋白的载体为绿蓝亮，红不亮或变弱，表明该蛋白具有去甲基化酶活性。希望这份指南能帮到大家，祝大家实验顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

四步搞定免疫荧光染色，简单又高效！想要做免疫荧光染色，但总觉得步骤太复杂？别担心，今天我来分享一个超级简单的四步免疫荧光染色法，让你轻松搞定！我们会在ibidi的Slide 8孔不可移除腔室载玻片中培养和染色贴壁细胞，以大鼠成纤维细胞为例，用多聚甲醛固定，再用线粒体染色MitoTracker对细胞核进行复染。当然，你也可以根据自己的需求使用其他固定技术和抗体染色。材料准备 Rat fibroblasts（细胞系） Slide 8 well, ibiTreat（ibidi, 80826） 2% Paraformaldehyde（PBS配制） 0.1% Triton⮠X-100（Fluka） 1% BSA in PBS（封闭液） 50 nM MitoTracker Green（Life Technologies） 0.1 /ml DAPI（Sigma）荧光显微镜（倒置），带有适当的滤光片组步骤一：培养细胞首先，在无菌条件下打开ibidi的Slide 8孔载玻片，放在Slide Rack或者适当的平面上。然后，准备细胞悬液（5 x 10 4细胞/ml），每个孔中加入300。盖上盖子后，把载玻片放入培养箱（37Ⰳ; 5% CO2），让细胞附着。培养至少3小时或者过夜。如果需要更长时间的细胞培养，建议几天后进行中等程度的交换。步骤二：固定、透化和封闭用细胞培养抽吸装置从孔中吸出细胞培养基。用Dulbecco PBS冲洗细胞，方法是将300缓慢加入每个孔。用约150 2% paraformaldehyde固定细胞20分钟。 20分钟后吸出液体，加入约150的0.1% Triton⮠X-100，10分钟后吸出液体，再用300 BSA封闭液洗涤细胞。步骤三：染色准备染色和抗体溶液。用150 DAPI溶液在室温下培养30分钟。用300 BSA封闭溶液洗涤细胞两次。用150 MitoTracker溶液培养45分钟。用300 BSA封闭溶液洗涤细胞两次。吸出溶液，逐滴添加约150的ibidi封片剂。步骤四：成像最后，在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞，你还可以选择用ibidi浸油来观察细胞。就这么简单！四步搞定免疫荧光染色，赶紧试试吧！𐟒ꀀ

冰冻切片全攻略：从新手到高手 𐟧Š 实验材料新鲜组织 H2O2 酒精丙酮 PBS DAPI工作液中性树胶 OCT 速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜 𐟔ꠥ–材尽快采取新鲜材料，防止组织死后变化。 ❄️ 速冻将组织块平放在软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。如果组织块小，可以适量加入OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。当盒底部接触液氮时开始气化沸腾，此时保持小盒原位，不要浸入液氮中，大约10-20秒组织即迅速冰结成块。制成冻块后，置入恒冷箱切片机进行冰冻切片。如果需要保存，快速用铝箔或塑料薄膜封包，立即放入-80℃冰箱贮存备用。 𐟓Œ 固定在样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或玻片上，样品托速冻。将组织置于样品托上，再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30分钟。 𐟔ꠥˆ‡片使用恒温冰冻切片机，将其置于低温密闭室内，切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10。切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5-10分钟，烘箱干燥20分钟。PBS洗5分钟㗳次。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 𐟌ˆ 免疫荧光染色冰冻切片室温晾干15分钟，用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时。滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（可以均匀覆盖组织面，保证过程中不会使组织干涸）。将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。第二天先将湿盒放到37℃回温1小时，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5分钟㗳次。滴加DAPI工作液染核，室温10-20分钟（工作浓度0.1%染色15分钟）。回收DAPI，滴加5-10抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察拍照。做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

免疫荧光染色全攻略：从破膜到封片免疫荧光染色是一种常用的细胞生物学技术，用于检测细胞内特定蛋白质的分布和定位。以下是详细的实验步骤和结果判读方法： 2. 实验步骤 2.1 细胞破膜：将爬片稍甩干后，用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈，以防止抗体流走。然后加入50-100破膜工作液，室温孵育20分钟。之后用PBS洗3次，每次5分钟。如果是膜蛋白染色，则不做破膜处理。 2.2 血清封闭：在圈内滴加3%BSA或10%驴血清（如果一抗是山羊来源），室温封闭30分钟。 2.3 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在细胞孔板里滴加按一定比例配好的一抗，细胞培养板平放于湿盒内4Ⰳ孵育过夜。 2.4 加二抗：细胞孔板置于脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。然后加入对应的二抗，室温孵育50分钟。 2.5 DAPI复染细胞核：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10分钟。 2.6 封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 2.7 采集图像：DAPI激发波长330-380nm，发射波长420nm；488激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。 3. 结果判读 DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，CY3通道阳性为红色，CY5通道阳性为粉色。

科研神器推荐：ibidi 8孔腔室载玻片大家好，今天我要给大家推荐一个超级实用的科研神器——ibidi的8孔腔室载玻片。作为一个国家重点实验室的科研人员，我真的是忍不住要和大家分享这个好东西。首先，这个载玻片最大的优点就是它可以同时培养8种不同的细胞，或者进行8种不同的染色，操作起来特别方便。想象一下，你以前可能要花好几个小时才能搞定的事情，现在只需要一个载玻片就搞定了，简直是科研人员的福音啊！其次，每个孔只需要200微升的培养基，真的是非常节省试剂。特别是对于那些涉及到细胞分化的实验，培养基可是相当昂贵的，这个设计真的是帮了大忙。再者，这个载玻片还特别容易保存。染色完成后，用confocal的油封闭保存，不用担心pbs或者dapi会干掉整个片子。具体用什么油可以参考说明书，ibidi的产品浸油兼容表也很详细。最后，最棒的一点是，这个载玻片不需要封片！这样一来，后续的观察和实验就变得更加方便了。总之，ibidi的8孔腔室载玻片真的是科研人员的好帮手，强烈推荐给大家！如果你也有类似的实验需求，不妨试试看吧。再次感谢刘姥姥千里走单骑的分享，也欢迎大家多多分享使用后的心得哦～

如何解读组织免疫荧光图：简单易懂指南嘿，大家好！今天我们来聊聊如何看组织免疫荧光图。其实，这种图在科研中特别常见，尤其是当你研究细胞表面蛋白的表达时。下面我就带你们一步一步了解这张图的内容。荧光标记：红色和蓝色首先，大家看到的是荧光标记。每张图中，CD36蛋白被标记为红色（通过荧光偶联的抗体实现），而细胞核染色呈蓝色（通常使用DAPI染料）。红色的分布代表CD36的表达情况，而蓝色则标记了每个细胞的位置。虚线是进行真表皮的区分。图像对比：正常体重 vs 肥胖接下来，大家会看到两排图像。左排是正常体重（Lean）小鼠的皮肤组织切片，右排是肥胖（Obese）小鼠的皮肤组织切片。每排图像中，上排的是对照组（Control），而下一排的是经过MC903处理的组（MC903）。比较左右两张图可以观察MC903对CD36表达的影响。结果解析：CD36的表达水平从图像可以看出，肥胖小鼠相较于正常体重小鼠显示有更强的红色信号，表明CD36的表达水平在肥胖小鼠中提高。MC903处理似乎进一步增强了CD36的表达，无论是在正常体重还是肥胖小鼠中。荧光强度定量：条形图最后，右方条形图是荧光强度的定量结果，即平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）的比较。这是通过量化图像中的红色信号强度来计算的。总结：MC903的作用通过这些图像，我们可以得出MC903在正常体重和肥胖状态下都能够增加CD36在小鼠表皮中的表达。这可能与脂肪代谢相关的皮肤病有关。希望这篇指南能帮你们更好地理解组织免疫荧光图！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

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