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感受态细胞前沿信息_感受态细胞的制备(2024年12月实时热点)

内容来源：飘花网电影所属栏目：教程更新日期：2024-11-30

感受态细胞

酵母杂交实验全攻略：从零开始到成功转化嘿，实验室的小伙伴们！今天我们来聊聊如何进行酵母杂交实验，特别是酵母感受态细胞的转化。这个过程虽然有点繁琐，但只要按照步骤来，其实也不难。让我们开始吧！第一步：准备 PEG/LiAc 溶液 𐟧ꊩ斥…ˆ，你需要准备 PEG/LiAc 溶液。这个溶液可是整个实验的关键，所以一定要配得准确。第二步：混合构建产物 𐟧슦Ž夸‹来，把 BD 载体构建产物和 AD 载体构建产物各 0.1  混在一起，再加入鲑精 DNA 0.1 mg。这个步骤很关键，因为它们是实验的基础。第三步：加入酵母感受态细胞 𐟍ž 现在，把 100  的酵母感受态细胞加入反应管中，轻轻混匀。这一步非常关键，因为酵母的感受态细胞是整个实验的“种子”。第四步：加入 PEG/LiAc 溶液 𐟧ꊧ„𖥐Ž，加入 0.6 ml 的 PEG/LiAc 溶液，再次混匀。这个步骤可以让酵母细胞更好地吸收构建产物。第五步：培养酵母细胞 𐟌᯸ 将反应管放入 30Ⰳ 的培养箱中培养 30 分钟。这段时间里，酵母细胞会开始吸收并表达你的构建产物。第六步：加入 DMSO 𐟒犥Š 入 70  的 DMSO，使其达到 10% 的终浓度，然后轻轻颠倒混匀。DMSO 的作用是保护酵母细胞在接下来的热休克过程中不受损伤。第七步：热休克处理 𐟔劥𐆥应管放入 42Ⰳ 的水浴中热休克 15 分钟。这一步非常关键，因为热休克可以激活酵母细胞的转化能力。第八步：冰浴处理 ❄️ 热休克完成后，立即将反应管放入冰浴中冷却 10 分钟。这样可以停止热休克反应，避免过度激活。第九步：离心沉淀细胞 𐟔„ 用 14,000 rpm 的转速离心 5 秒，沉淀细胞。这一步是为了收集转化后的酵母细胞。第十步：重悬细胞 𐟒犦œ€后，用 IxTE 重悬细胞。这样你的酵母杂交实验就完成了！希望这篇指南能帮到你们，祝大家实验顺利！如果有任何问题，欢迎随时留言讨论哦！

大肠杆菌感受态细胞的制备指南 𐟌€ 𐟌Š 互联网的记忆总是那么强大，所以我决定写下这份实验指南，方便以后查阅。 𐟧Š 实验前准备：提前一天配制0.1 mol/L的CaCl2溶液，并进行灭菌处理，然后放入冰箱预冷。将大肠杆菌摇至OD600值小于0.5（我一般摇到0.35~0.45左右）。 𐟔젥ꌦ�꤯𜚊将无菌的1.5ml离心管插入碎冰中预冷10分钟（一般做10管预冷10分钟），然后将菌液分装到各个离心管中。分装完后，继续插入冰中放置10分钟，然后4℃、5000g离心10分钟。用枪小心吸净上清液（也可以倒置倒尽上清液），然后加入1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，用枪小心吹匀（不要吹出泡沫），插入冰中放置30分钟（等待期间可以将CaCl2重新放回冰箱，保持冰冷状态）。 4℃、5000g离心10分钟，弃上清后用200ul冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，再次插入冰中放置30分钟（操作同上一步）。 4℃、5000g离心10分钟，弃上清后用200ul冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，按每管100ul分装到0.5ml离心管中（离心管提前做好标记，也可以预冷一下），放入-70℃冰箱保存。 𐟓ˆ 共制得20管感受态细胞。

𐟧전H5ˆ𖥤‡的魔法原理 𐟔 想要了解DH5ˆ𖥤‡的神奇原理吗？那就跟我一起来探索吧！ 𐟌𑠥œ谢„ƒ的条件下，利用钙离子作为媒介，大肠杆菌在CaCl₂低渗溶液中会膨胀成球形，细胞膜的通透性也会因此增加。 𐟒𜠨𝬥Œ–混合物中的质粒DNA与钙离子携手，形成一种坚韧的羟基-钙磷酸复合物，这个复合物能粘附在细菌细胞表面，大大提高了DNA进入细胞的几率。 𐟔堦Ž夸‹来，通过42℃的短暂热击处理，可以促进细胞对DNA复合物的吸收，让转化更加高效。 𐟌᯸ 热击后，感受态细胞被放入无抗性的液体培养基中，在37℃下孵育和复苏。这样，转入的外源DNA所携带的筛选标记等基因就能得以表达，产生抗性，比如对氨苄青霉素的抗性。 𐟎‰ 最后，将复苏后的大肠杆菌涂布在带有抗性的固体筛选培养基平板上进行筛选，就能得到我们心仪的DH5•毼 ✨ 通过这个过程，我们可以制备出转化率高达5㗱06～2㗱07转化子/质粒DNA的DH5„Ÿ受态细胞，满足各种基因克隆试验的需求。 𐟒ᠦ˜露是觉得这个过程既神奇又有趣呢？那就赶快试试吧！

手把手教你构建质粒载体嘿，大家好！今天我们来聊聊如何用质粒构建技术来搞定你的科研项目。作为一个科研小白，这个过程可能会让你有点头大，但别担心，我来帮你理清楚！第一步：双酶切 𐟔ꊩ斥…ˆ，你需要选择合适的酶切位点。这一步是整个过程的起点。常见的酶切体系是这样的：内切酶1：1 内切酶2：1 酶缓冲液：5（根据浓度）载体：2 ddH₂O：补齐到50 37℃酶切1小时。记得在酶切前算好量，先加ddH₂O，最后加内切酶。第二步：切胶回收 𐟧슩…𖥈‡完成后，你需要跑琼脂糖胶来鉴定酶切效果。配胶时注意选择合适的胶浓度，分子量越大，胶浓度越小。跑胶完成后，紫外灯下一般会有两段，分别是载体和切下来的片段。根据结果进行胶回收，注意切下来的片段不回收。胶回收完成后测浓度备用。第三步：连接 𐟔— 插入片段可以根据自己的实验选择，通常可以通过PCR获得，或者是由三方公司合成的序列。在连接开始前，也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下：酶切后的载体：25ng 插入片段：1 T4 ligase buffer：1 T4连接酶：1（根据浓度） ddH₂O：补齐至10 16℃连接4小时以上或过夜。记得加入载体和插入片段的量由说明书得来，加样前计算好量，先加ddH₂O，最后加连接酶。小tips：为确保连接的顺利进行，务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用，不能混用。第四步：转化 𐟦 进行转化时，根据载体说明书选择合适的感受态细胞，常用DH5€‚同时仔细阅读感受态细胞说明书，看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。第五步：挑取单克隆 𐟧𘊦졦—妗餸Š，挑取单克隆，推荐至少选择两个及以上。第六步：摇菌 𐟍𚊦‘‡菌时，注意拧松菌管的盖子或者使用封口膜，倾斜放入恒温（一般为37℃）摇床，摇菌时间8小时为宜。第七步：提质粒送测序 𐟧슦‘‡菌完成后进行质粒提取，测浓度后送测序。注意这里会有部分说明书推荐选择新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定，这也是一种鉴定方式，可以根据酶切片段的大小来判断重组是否正确，但是最终确定还是推荐进行测序。第八步：保菌 𐟧Š 对测序正确的菌株进行保菌，并提质粒进行后续实验。小贴士 𐟒ከ𔨧𒒦ž„建方法多种多样，小伙伴们也可以选择同源重组的方法进行哦！希望这些步骤能帮到你，祝你的科研之路顺利！

CRISPR-sgRNA文库构建全攻略𐟔슰ŸŒˆ 实验目的掌握CRISPR-sgRNA文库构建的原理和操作步骤。构建针对特定基因的sgRNA文库，用于基因编辑研究。 𐟧ꠥꌦ料试剂𐟧ꊧ𛆨Œ感受态细胞（如DH5a） pUC57载体模板DNA 引物 dNTPs Taq酶 T4DNA连接酶限制性内切酶（如BsmBl或BbsI）琼脂糖磷酸缓冲液 70%乙醇无菌水仪器𐟔슐CR仪器琼脂糖凝胶成像系统微量移液器离心机恒温培养箱净化工作台 𐟓 实验步骤设计sgRNA序列𐟓 依据目标基因设计特异性sgRNA序列，避免脱靶。合成sgRNA模板𐟖‹️ 配制PCR反应体系：模板DNA：10 ng 引物：10 pmol/L dNTPs：0.2 mM Taq酶：1U 磷酸缓冲液：5 无菌水补足至50 进行PCR反应： 95℃预变性5 min 95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环 72℃延伸10 min 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物𐟔슥‡†备1.5%琼脂糖凝胶。与DNA marker一起电泳。观察确认产物大小正确。切割载体✂️ 用限制性内切酶切割pUC57载体。琼脂糖凝胶电泳检测切割效果。连接sgRNA模板与载体𐟔— 将PCR产物与切割后的载体进行T4 DNA连接。 16℃过夜连接。转化感受态细胞𐟦 连接产物与感受态细胞混合，冰浴30 min。 42℃热激90 s。冰浴2 min。加入适量LB培养基，37℃培养1 h。筛选阳性克隆𐟔 挑取单个菌落进行PCR验证。确认阳性克隆后提取质粒。测序验证𐟔⊦取的质粒测序验证sgRNA序列是否正确。 ⚠️ 实验注意事项保持无菌环境防止污染。 PCR防止引物二聚体产生。内切酶切割载体确保完全切割。转化感受态细胞注意热激时间控制。

酵母双杂交实验指南：从零开始到成功酵母双杂交系统（Yeast two hybrid，Y2H）是一种强大的工具，用于研究两种蛋白质之间的相互作用。通过将这两种蛋白质分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，我们可以构建融合表达载体，从而分析它们之间的相互作用。 𐟔砩…𕦯感受态细胞的制备 1️⃣ 将-80℃保存的酵母菌株在YPDA固体培养基平板上划线，30℃培养条件下倒置培养4-7天。 2️⃣ 挑取单菌落至含3毫升YPDA液体培养液中。 3️⃣ 30℃培养，200rpm震荡培养8小时。 4️⃣ 当菌液OD值约为0.3时，转移10微升菌液到含50毫升YPDA培养液中。 5️⃣ 30℃培养，200rpm震荡培养16-20小时至OD值为0.15-0.3。 6️⃣ 700g转速5分钟室温离心收集细胞。 7️⃣ 将底部沉淀使用已预热至30℃的100毫升YPDA中重悬酵母细胞。 8️⃣ 30℃，200rpm，摇3-5小时至OD值=0.6。 9️⃣ 5分钟室温离心收集细胞。 𐟔Ÿ 将底部沉淀在30毫升无菌超纯水中重悬酵母细胞。 1️⃣1️⃣ 700g转速5分钟室温离心收集细胞。 1️⃣2️⃣ 将底部沉淀加入3毫升的1.1XTE/LiAc重悬细胞。 1️⃣3️⃣ 将重悬细胞分成2管，6000g转速室温离心30秒。 1️⃣5️⃣ 将底部沉淀加入500微升的1XTE/LiAc重悬酵母细胞，分装为100微升每管。通过以上步骤，你就可以成功制备酵母感受态细胞，为后续的酵母双杂交实验打下基础。记住，每一个步骤都要细心操作，以确保实验的成功。𐟒갟Œ𑀀

𐟔젧”Ÿ物学实验：目的基因导入受体细胞 𐟌🠥ˆ𖥤‡感受态细胞 𐟔砦𐯥Œ–钙法 1️⃣ 接种受体菌，挑取单菌落于LB培养基中，37℃摇床培养过夜。 2️⃣ 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，37℃摇床上剧烈培养2.5-3小时。 3️⃣ 氯化钙溶液置于冰上预冷。 4️⃣ 取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，冰上冷却10分钟。 5️⃣ 4℃下30000g冷冻离心5分钟。 6️⃣ 弃去上清，加入100微升预冷0.1M氯化钙溶液，移液枪混匀，重悬细胞，冰上放置20分钟。 7️⃣ 细胞悬浮液可立刻用于转化实验或添加冷冻保护剂后冷冻保存（-70℃）。 𐟔‹ 电转化法 1️⃣ 挑取单菌落于5mlSOB培养基中，培养过夜。 2️⃣ 取培养物500微升转接入50mlSOD培养基的摇瓶中，200r/min37℃下振荡培养至OD600约为0.5，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷半小时。 3️⃣ 预冷的50ml离心管于4℃5000r/min下离心5分钟，弃上清。 4️⃣ 用预冷的水重悬菌液，然后加满水，4℃5000r/min离心5分钟，弃上清。 5️⃣ 用10%甘油重复步骤4两遍，4℃5000r/min下离心5分钟，最后一次倒尽上清液后，用残存管底的甘油悬浮细胞。 6️⃣ 保存。 𐟔„ 转化 𐟔堧ƒ�𛦳•转化 1️⃣ 选择相应抗性的LB培养基。 2️⃣ 取出感受态细胞融化，取50微升，加入目的片段，轻轻混匀后冰上放置30分钟。 3️⃣ 42℃热击30s，立即冰浴2分钟。 4️⃣ 在超净工作台中加入800微升无抗性的LB液体培养基，37℃200rpm培养1小时，复苏细菌。 5️⃣ 低速离心2分钟，倒掉上清，用移液器将菌体与残留上清混匀，用涂布棒将菌液均匀涂在LB固体培养基上，37℃培养过夜。 ⚡ 电转化法 1️⃣ 选择相应的培养基平板。 2️⃣ 取出感受态细胞融化，加入1微升连接产物，轻轻混匀后冰上放置。 3️⃣ 电转化仪选择1800V作为输出电压。 4️⃣ 将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，立即按下按钮电击。 5️⃣ 立即加1mlSOC培养基到转化杯中重悬细胞。 6️⃣ 将细胞转入合适的培养管中37℃培养1小时。 7️⃣ 吸取合适体积的菌液涂布，37℃培养过夜。

科研新手必看！电转感受态实验全攻略𐟔스𘀯𜎧”𕨽젰ŸŒ𗊥‡†备工作：取一个EP管，加入500ul LB液体培养基。将电转杯用酒精清洗干净，再用双蒸水冲洗，最后用吹风机吹干内壁（确保无水，否则容易爆杯）。将电转杯插入冰盒中预冷。取50ul电转感受态细胞，加入1~2ul质粒，混匀后放入电转杯底部。使用电转仪，第一步选择4 Pre-set protoools并按Enter键，第二步选择1 Bacterial并按Enter键，第三步选择2 E.Coli-2mm，2.5KV并按Enter键。听到“滴”一声即电转结束。将EP管中的LB培养基加入电转杯中，与其混匀后吸回EP管。将其放入37℃ 220r摇床1小时。结束后5000r离心2分钟，剩余50ul进行平板（含抗性）划线，37℃孵箱过夜。

QuikChange法突变，详解！ QuikChange法适用于点突变（或相邻多个位点突变）、基因删除、小片段基因插入或替换。虽然其他步骤相同，但引物设计略有差异。以下是详细原理和操作方法：简要原理 𐟓œ QuikChange法相当于对整个质粒进行PCR（环P）。利用带有反向互补序列的引物，将整个质粒进行PCR扩增。PCR过程中，质粒形成环状，转化大肠杆菌后缺口被修补。实验方法 𐟧ꊤ𛥥Œ链质粒为模板进行PCR扩增（PCR退火温度根据引物确定，延伸时间根据整个质粒长度及DNA聚合酶确定）。模板量可以减少到1-5ng/50，循环数可减少至25-28个。 PCR条件示例 𐟔効5℃，5min，1循环 95℃，30s 60℃，30s 72℃，4min，25循环 72℃，10min，1循环 PCR后最好先跑胶确认有没有条带。虽然有很多人说PCR后没有条带也正常，转化依然可以长出菌落，但个人经验：如果无条带或者条带弥散，转化大概率不会长。 Dpn酶切 𐟔ꊦ‰饢ž产物用Dpn酶切去除甲基化的质粒模板。Dpn酶切条件示例： 10㗢uffer：2 DpnI：1 37℃孵育2小时。转化与验证 𐟧슥𐆩…𖥈‡后的产物转化DH5a/Top10感受态细胞，进行菌落PCR和测序验证。详细原理 𐟔스𛥨𔨧𒒄NA作为模板，在高保真聚合酶作用下，使用两条具有同源序列的引物引导DNA合成。两条引物内均含有预定突变位点，经过多轮热循环，双链质粒DNA的全长均以线性形式扩增。由于引物含有同源序列，最终产生DNA双链带交错缺口的突变质粒。经过高保真酶扩增而得到的DNA产物具有缺口，DNA链的磷酸二酯键并未闭合，非闭合环形质粒同样也能被大肠杆菌细胞吸收，断裂的缺口可在质粒进入感受态细胞内后被修补。甲基化修饰 𐟧ꊥŽŸ来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切开（Dpnl识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次）。而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。通过以上步骤，你就可以成功设计并操作QuikChange法突变引物啦！

DB3.1&CCDB，新机遇！ 𐟌€ 在分子生物学的研究中，DB3.1感受态细胞和CCDB质粒扮演着至关重要的角色。DB3.1感受态细胞，因其含有gyrA462基因，对CCDB基因产物的毒性具有抵抗作用，成为了高效扩增携带CCDB质粒的理想选择。 𐟔 CCDB质粒，也被称为pCCDB，是一种特殊的质粒，含有CCDB（Coupled Cell Extract Death protein B）基因。这个基因能够在大肠杆菌中诱导细胞死亡，使得CCDB质粒在筛选过程中非常有用。只有带有目标质粒的克隆能够在含有CCDB毒性基因的培养基上存活，这种筛选方法比传统的抗生素选择方法更加直接和有效。 𐟒‰ 高效性是CCDB系统的显著特点。几乎所有未转化的细胞都会因为CCDB的作用而死亡，从而大大提高了筛选的精确度和效率。CCDB质粒在质粒构建中通过其特有的选择标记和毒性基因，使得质粒转化和筛选过程更为高效和可靠，成为了质粒工程中的重要工具之一。 𐟒„ 最近，有人尝试使用磁吸假睫毛来化妆，但效果并不理想。相比之下，DB3.1感受态细胞和CCDB质粒在科学研究和工程应用中展现了巨大的潜力。 𐟔젩€š过利用CCDB的毒性，科学家们能够筛选出带有特定质粒的菌落，这在质粒构建和克隆过程中至关重要。而DB3.1感受态细胞的高效扩增能力，则为这一过程提供了强有力的支持。 𐟌ˆ 总之，DB3.1感受态细胞与CCDB质粒的组合，为分子生物学研究和应用带来了新的可能性和机遇。

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