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三种蛋白样品脱盐方法优缺点对比 蛋白质样品脱盐是生物实验中的关键步骤,以下是三种常用的脱盐方法及其优缺点对比: [一R] 透析法 基于透膜能力去除小分子盐。 优点: 价格较低 适用于对盐浓度敏感的蛋白质,处理过程温和,操作简便 透析后样品体积较小 缺点: 透析过程耗时较长 需要大量缓冲液 透析袋可能泄漏,导致样品丢失,重复使用次数有限 样品易沉淀失活 盐分去除不完全 [二R] 超滤法 犥駔触力作用和超滤膜去除小分子盐。 优点: 处理时间短 操作简单 透析后样品体积较小 缺点: 蛋白回收率低 蛋白易失活 价格较高 [三R] 脱盐柱法 駔襇胶过滤柱去除盐分。小分子盐进入凝胶颗粒内部后洗脱出来,大分子蛋白被排阻在凝胶外,先从凝胶间隙洗脱出来。 优点: 处理时间短 重复使用次数多 操作简单温和,不易失活 蛋白回收率高 能完全去除盐分 缺点: 凝胶过滤后样品体积较大 通过以上对比,可以根据实验需求选择最适合的脱盐方法。
样本脱盐的三种常用方法 样本脱盐主要有三种方法:超滤管脱盐、离心柱脱盐和透析袋脱盐。 超滤管脱盐 超滤管脱盐的原理是在离心管内植入一张膜,利用膜表面孔径大小,在离心力的作用下,将样本中的大分子物质和小分子物质分开。溶液中的溶剂和小分子量物质、无机离子,从高压侧透过超滤膜进入低压侧,并作为滤液排出;而溶液中大分子物质、胶体微粒及微生物等被超滤膜截留。 优点:可以进行浓缩,上样的样本量可以比较大。 缺点:重复使用频次低,价格高,膜容易破。 离心式快速脱盐柱 离心式快速脱盐柱根据填料颗粒粒径不同,将分子量大小不同的物质分离开来,可以在出色地完成蛋白质脱盐的同时保持极高的回收率,无需装柱。 优点:处理速度快,回收率高。 透析袋脱盐 犩析袋通常是由半透膜制成的袋状容器,这个半透膜是有大小孔径的,在生物大分子的制备过程中,除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质时都要用到透析的技术。 使用过程中将样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中大分子量的生物分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。 优点:样本装入透析袋后可以直接放4度冰箱过夜,不用管他;处理的样本量可以很大,平均价格比较低。 缺点:透析时间比较长,如果你急需样本,不能选用这个方法;透析后会稀释样本。
蛋白脱盐全攻略:脱盐柱使用详解 最近一直在忙各种文章和实验室的事情,还帮师妹们准备中期汇报和开题汇报的PPT。上周教师妹用了脱盐柱,今天就来详细记录一下使用方法和原理。 实验室使用的脱盐柱型号是Cytiva的PD-10(如图2 3)。 脱盐柱的原理:PD-10脱盐柱内装有Sephadex G-25树脂,可以根据分子大小的不同来分离高分子量和低分子量物质。 脱盐方式:采用重力法。 详细步骤如下: 1️⃣ 控制Pr纯化液的体积在5ml左右(超滤浓缩)。 2️⃣ 用4ml的ddH2O洗三次。 3️⃣ 用1x binding buffer(低盐100mM NaCl)平衡三次。 4️⃣ 加入2.5ml的Pr液,逐滴流下为流川(不要的废液,也可以制样跑胶检测)。 5️⃣ 加入3.5ml的1x binding buffer,逐滴流下为Pr脱盐液。 6️⃣ 加入4ml的1x binding buffer洗一次,再重复第4️⃣5️⃣步。 7️⃣ 用4ml的ddH2O洗三次,20%乙醇4度保存柱子(回收用于同一蛋白的脱盐)。 ⚠️ 注意事项:脱盐后蛋白会被稀释,且会有损失。如果蛋白表达量低且珍贵,建议使用透析法脱盐。 祝大家科研顺利,早日毕业!
脱盐柱 Thermo Scientific Zeba 脱盐离心柱(货号89890)是一款专为高效脱盐和缓冲液交换设计的离心柱产品,广泛应用于蛋白质、生物分子和酶等样品的纯化和浓缩。以下是对该产品的详细介绍,涵盖其特点、技术参数、应用和优势。 砤恧똦脱盐和缓冲液交换:Zeba 脱盐离心柱采用高效脱盐树脂,能够快速去除小分子如盐类和缓冲液组分,同时保留大分子目标物质(如蛋白质)。其7K的分子量截断(MWCO)适用于大多数蛋白质和生物大分子的纯化需求。 高样品回收率:离心柱设计优化,最大限度减少非特异性吸附,确保高样品回收率。典型回收率可达95%以上,确保样品损失最小化。 简单快速的操作流程:Zeba 脱盐离心柱的操作非常简单,只需几步即可完成脱盐和缓冲液交换。样品上样后,通过离心快速实现分离,整个过程仅需几分钟,大大提高了实验效率。 无需预平衡:与传统的凝胶过滤柱不同,Zeba 离心柱无需预平衡步骤,直接上样即可使用。这不仅简化了操作流程,还减少了时间消耗。 无蛋白质结合材料:离心柱材料不与蛋白质结合,确保样品纯度和回收率。适用于多种蛋白质和生物分子的纯化和浓缩。 技术参数 分子量截断:7K(7000)Daltons 样品容量:每柱可处理2 mL样品 操作时间:典型操作时间为5分钟 离心条件:离心速度:1000-2000 㗠g;离心时间:2-5分钟 产品规格:包装:25个柱/盒;货号:89890 ️ 应用领域 蛋白质纯化和浓缩:Zeba 脱盐离心柱广泛应用于蛋白质的脱盐和缓冲液交换,适用于重组蛋白、抗体、酶等的纯化和浓缩。其高效的脱盐能力和高样品回收率使其成为蛋白质研究中的理想工具。 酶反应优化:在酶反应研究中,Zeba 脱盐离心柱用于去除反应体系中的小分子抑制剂或副产物,优化酶反应条件,提高反应效率和产物纯度。 核酸纯化:该离心柱也适用于核酸的脱盐和缓冲液交换,去除PCR产物或核酸制备过程中引入的盐类和缓冲液组分,提升核酸的纯度和下游应用的效果。 样品制备:Zeba 脱盐离心柱在样品制备中用于去除样品中的盐类和小分子杂质,确保样品在后续分析(如质谱分析、HPLC分析)中的高纯度和准确性。
如何在标准品上做标记 抗体预处理 将待交联的抗体(浓度≥1mg/mL,推荐2-5mg/mL)在4℃下透析三次,使用交联反应液(配制方法:7.6g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1L),直至pH=9.0。 砩 制荧光染料溶液 犥𐆆ITC溶于DMSO中,浓度为1mg/mL。每次使用时需新鲜配制,避光保存。 添加荧光染料 按P:F(蛋白质:FITC)=1mg:150的比例,将FITC缓慢加入抗体溶液中,边加边轻轻晃动,使其均匀混合,暗处4℃反应8小时。 ❌ 终止反应 ❌ 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L,4℃下终止反应2小时。 🠥䥤余荧光染料 物在PBS中透析四次以上,直至透析液清亮。 젤物鉴定 슨白浓度(mg/mL)= [A280 - 0.31 㗠A495] / 1.4 F/P比例:3.1 㗠A495 / [A280 - 0.31 㗠A495],该值应介于2.5~6.5之间。 加入保护剂 将FITC交联的蛋白置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,4℃避光保存。 注意事项 FITC在处理过程中应尽量避免暴露在光下,因为FITC对光敏感。 正确的抗体浓度和FITC的添加量至关重要,如果FITC添加过多,可能导致非特异性结合;如果添加不足,可能不会得到足够强的荧光信号。 确保在处理过程中使用纯净无菌的工具和试剂,以避免抗体被污染。 反应后要立即进行纯化处理,否则FITC可能会对抗体造成氧化损害。 标记完成后,应立即应用或冷冻保存,避免长时间储存。 ️ 快速离心脱盐柱的使用方法 ️ 在抗体预处理时,如果没有透析袋或嫌透析麻烦,可以直接使用快速离心脱盐柱。 配制交联反应液后,用该反应液平衡快速离心脱盐柱。 将样本上柱离心,离心后的样本与透析后的样本液相同。 在去除多余荧光染料时,也可以使用快速离心脱盐柱,方便快捷。 在加入磷酸盐缓冲液时,同样可以使用快速离心脱盐柱来置换缓冲液。
引物纯化哪家强?比拼揭晓! 引物纯化是分子生物学实验中至关重要的一步,它关系到后续实验的成败。以下是几种常见的引物纯化方法,它们各有千秋,适用于不同的实验需求。 HAP纯化(高亲和性纯化) HAP纯化基于DMT(二甲基三苯甲基)基团对HAP树脂的特异性吸附。在纯化过程中,含有DMT基团的目的DNA能够特异性地吸附到HAP树脂上,而短链DNA则不会被吸附。这种方法能够显著提高引物的纯度,甚至可以达到98%以上,与PAGE、HPLC等传统纯化方法相媲美。 ✅ 特点 高纯度:HAP纯化方法能够显著提高引物的纯度,有报道称其纯度可达到80%~90%,甚至在某些情况下可以达到98%以上,与PAGE、HPLC等传统纯化方法相媲美。 快速高效:相比其他纯化方法,HAP纯化过程更加快速。例如,用HAP方法纯化的引物一轮只需2小时,可以显著缩短交货时间,提高实验效率。 成本效益:HAP纯化方法不仅速度快,而且成本相对较低。这使得它在科研和生产中具有更高的经济效益,有助于节约科研经费和时间。 适用范围广:HAP纯化方法适用于多种分子生物学实验,包括DNA测序、基因合成、PCR反应、点突变、分子杂交和基因芯片技术等。特别是对于长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品,HAP纯化方法能够提供高质量的纯化效果。 砨𑧛纯化(DSL,C18柱脱盐) 脱盐纯化又称为简易反相柱纯化,其原理是利用柱子对DNA的特异性吸附,这种吸附可以被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱。因此,该方法能有效地去除引物中的盐分,但并不能有效去除比目的片段短的小片段。 ✅ 特点 速度快、成本低:这种方法速度快、成本低,适用于大多数常规分子生物学实验,但对于需要高纯度的应用(如测序、克隆)则不适用。 OPC纯化 OPC(Oligonucleotide Purification Cartridge)纯化是基于DNA保护基(DMTr基)和纯化柱中树脂间的亲合力作用。在合成过程中,DNA片段的5'-端会保留一个DMTr基团,这个基团可以与纯化柱中的树脂特异性结合。通过一系列洗脱步骤,可以去除未结合的杂质和短片段,从而得到高纯度的目的DNA。 ✅ 特点 适用于短引物:OPC纯化适用于长度在40mer以下的引物,纯度通常大于95%。这种方法适用于多种实验需求,包括PCR、测序和探针制备等。 以上几种纯化方法各有千秋,选择合适的方法可以提高实验效率和质量。希望这些信息对您有所帮助!
G25脱盐纯化与聚酰胺柱的神奇应用 G25脱盐纯化: G25脱盐纯化柱利用经典的葡聚糖和环氧氯丙烷交联介质,通过分子筛原理去除小分子,进行脱盐和置换缓冲液。凝胶过滤层析利用分子大小限制大分子通过多孔介质,使小分子通过介质,从而达到分离纯化的目的。它可以从核酸、蛋白溶液中去除分子量小于5KD的物质,例如乙醇、盐、荧光物质和糖等。G25脱盐纯化柱采用聚丙烯材料,耐受酸碱和大部分有机溶剂;筛板采用超高分子量聚乙烯材料,不引入其他杂质污染;具有极高的选择性;粗颗粒流速较快,细颗粒流速较慢,分辨率较高;纯化时间短,缓冲液消耗量低。G25脱盐纯化柱被越来越多的用于从实验室到工业规模的脱盐和小分子去除。 🠥 𘥞应用: DNA分子和蛋白的脱盐纯化 其他生物分子的纯化 砰olyamide聚酰胺: 聚酰胺柱利用反相机理,通过化合物羟基基团与树脂的酰胺基团之间的强烈氢键作用,从水溶液或甲醇溶液中吸附极性化合物(-OH基团,尤其是酚醛化合物)。它用于萃取单宁、叶绿素、腐殖酸、药理活性的类萜、黄酮类、没食子酸、儿茶酚A、原儿茶酸和间苯三酚等。也可用于萃取芳族羧酸和硝基芳香化合物,不可逆地保留苯醌。 𑠥訌围: 土壤 石油 体液(血浆/尿等) 食品等 典型应用: 用于萃取单宁、叶绿素、腐殖酸、药理活性的类萜、黄酮类、没食子酸、儿茶酚A、原儿茶酸和间苯三酚等 用于萃取芳族羧酸和硝基芳香化合物,不可逆地保留苯醌。
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