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质粒转化最新视觉报道_质粒的三种形态电泳速度(2024年12月全程跟踪)

内容来源：飘花网电影所属栏目：热点更新日期：2024-12-01

质粒转化

𐟔젨𔨧𒒄NA转化大肠杆菌全攻略 𐟌𑊦Ž⧴⨴觲’DNA转化大肠杆菌的奥秘，让你的实验室操作更加得心应手！𐟏�芊𐟔 转化步骤一览： 1️⃣ 准备感受态细胞：选择合适的大肠杆菌菌株，并制备感受态细胞。 2️⃣ 准备质粒DNA：确保质粒DNA的质量和纯度，准备用于转化的质粒。 3️⃣ 转化过程：将质粒DNA与感受态细胞混合，进行转化操作。 4️⃣ 筛选阳性克隆：通过抗生素筛选或其他方法，筛选出含有质粒的阳性克隆。 𐟔‘ 关键点与注意事项： 𐟧Š 感受态细胞的制备：确保细胞处于最佳状态，以提高转化效率。 𐟧𜠨𔨧𒒄NA的纯化：使用合适的纯化方法，去除杂质，提高转化成功率。 𐟒‰ 转化条件：控制好转化温度和时间，避免过度转化或转化不足。 𐟔젧훩€‰方法：选择灵敏度高、特异性强的筛选方法，确保阳性克隆的准确性。 𐟓𘠥ꌦŠ契Š图片： 𐟖𜯸 转化前：展示感受态细胞和质粒DNA的准备状态。 𐟖𜯸 转化中：记录转化过程的操作步骤和关键点。 𐟖𜯸 转化后：展示筛选出的阳性克隆，并进行初步验证。通过这些步骤和注意事项，让你的质粒DNA转化实验更加顺利和高效！𐟚€𐟌Ÿ

GST-pull down实验全攻略𐟓– 今天给大家介绍一种超实用的GST-pull down实验！这可是研究蛋白质相互作用的好方法哦𐟧。 𐟑‰实验原理： GST-pull down实验利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合的蛋白质（诱饵蛋白）与谷胱甘肽亲和树脂结合，从而捕获与之相互作用的蛋白质（捕获蛋白）。下面是具体步骤𐟑‡： 𐟌Ÿ蛋白表达与纯化：将GST标签的质粒转化到大肠杆菌（如BL21感受态细胞）中。诱导表达GST融合蛋白，收集细菌。用超声破碎细菌，收集含有GST融合蛋白的细胞裂解液，然后用谷胱甘肽亲和层析纯化GST融合蛋白。 𐟌Ÿ实验设计：设计实验组和对照组，实验组用GST-诱饵蛋白，对照组用单独的GST蛋白。蛋白质量要合适，一般500的诱饵蛋白GST-A即可。 𐟌Ÿ孵育与结合：将纯化好的GST融合蛋白与谷胱甘肽珠子在4Ⰳ孵育数小时，确保充分结合。将珠子和含有潜在互作蛋白的细胞裂解液或纯化的蛋白质溶液混合，在4Ⰳ过夜孵育。 𐟌Ÿ洗涤与洗脱：用预冷的PBS或特定洗涤液洗珠子，去除未结合的蛋白质。用含有不同浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液洗脱结合的蛋白质复合物。 𐟌Ÿ检测与分析：通过Western blot或质谱（MS）分析洗脱的蛋白质，验证蛋白质之间是否有相互作用。还可以用考马斯亮蓝染色或Silver staining评估纯化蛋白的量和纯度。 𐟌Ÿ结果解读：如果实验组检测到预期的互作蛋白，而对照组没有，说明GST融合蛋白和互作蛋白之间有特异性相互作用。注意：GST-pull down实验虽然简单、快速有效，但通常还需要共免疫沉淀（Co-IP）等实验来验证细胞内蛋白质相互作用是否真实存在𐟤—。

一、GST/His-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST/His的重组质粒转化到BL21菌株中； (2)挑取单克隆到含有5 ml LB培养基（加入5 氨苄）的10 ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜； (3)将培养菌液转移到含有500 ml LB（含500 氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时； (4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16 h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）； (5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 ml离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中； (6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 ml菌液沉淀1 ml PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中； (7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清； (8)将超声后的溶液4℃ 4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。二、GST/His-a融合蛋白的纯化 (1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积磁珠，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min; (2)4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，该磁珠上结合了GST/His-a融合蛋白； (3)加入500 预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将磁珠洗涤一次，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次； (4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST/His-a的磁珠。关于凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）,如有相关科研问题，欢迎留言探讨。 #科研学习#⠂ #研究生日常#⠂ #泛素化修饰#⠂ #实验室日常#⠂ #EMSA#

𐟔젦„Ÿ受态细胞的多样性选择与使用指南 𐟓– 感受态细胞1.1每支来自喀斯玛锐竞，提供100/支，适用于多种菌种，包括DH5€Top10、JM109、Stbl3和BL21等。选择合适的感受态细胞对于基因克隆实验至关重要，以下是详细的使用感受和步骤： 𐟔 选择适宜的感受态细胞：根据序列的结构、长度、载体种类以及特殊要求等，选择合适的感受态细胞。例如，DH5’ŒTOP10适用于蓝白斑筛选、高效克隆和质粒抽提；JM109是甲基化酶缺陷型；DH10B适用于文库构建、长片段质粒克隆和150bp质粒转化；Stbl3适用于克隆不稳定插入片段、正向重复和逆转录病毒序列；Stbl4则适用于克隆甲基化基因组序列。 𐟔砥“转化实验步骤：取100冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻混匀后冰上静置30分钟。将混合物在42℃水浴中热激45-60秒，迅速转移至冰浴中，静置2分钟。注意在冰上静置过程中不要晃动样品，以免降低转化效率。向离心管中加入700不含抗生素的无菌液体培养基（SOB或LB），混匀后37℃、200rpm复苏60分钟。根据实验需要，取合适体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的SOB或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。通过以上步骤，您可以选择合适的感受态细胞进行基因克隆实验，确保实验的成功和准确性。

实验室必备：质粒DNA制备全攻略 𐟔젥ꌤ𛋧𛍊质粒DNA制备是一种重要的分子生物学技术，用于重新克隆已有的DNA片段，以便进行进一步的分析或重组改造。它具有高效率、适用于多数菌株、产物纯化后可用于多种DNA重组操作等优点，广泛应用于转化细胞、细胞转染、酶切分析和DNA重组等领域。 𐟧ꠦ料与设备材料试剂 TE缓冲液高速/超速离心机异戊醇苯酚乙醇氢氧化钠氯仿异丙醇十二烷基硫酸钠（SDS） 3M乙酸钠酵母缺陷型培养基（一缺）仪器设备 MagicBook 𐟓 详细步骤质粒DNA的制备过程包括多个步骤，如细胞培养、收集菌体、裂解细胞、纯化DNA等。每个步骤都需要特定的试剂和设备，以确保实验的顺利进行。通过这一技术，研究人员能够更好地理解和操控DNA，为后续的实验打下基础。

质粒构建全攻略：从零开始到成功转化 𐟎‰ 看着那些又大又圆的转化子，心情是不是特别美妙？质粒构建其实并不难，只要掌握了基本流程和技巧，你也能轻松搞定！下面我就来详细讲解一下质粒构建的整个过程。质粒构建的基本流程 𐟓œ 首先，我们需要准备好插入片段和载体。插入片段可以是gDNA、cDNA或者已有的质粒，只要上面有你需要的片段就行。然后，用PCR扩增出目标片段，回收这个片段。注意，PCR一般用pfu酶，如果扩增不好可以试试g或者保真较好的Taq。设计引物 𐟔犊设计引物时，需要在引物末端加入合适的酶切位点，这样可以让插入片段和载体进行连接。常见的酶切位点有Sacl、HindIII、EcoRI和KpnI等。你也可以采用同源臂的设计，让载体和插入片段通过同源重组进行连接。去磷酸化处理 𐟌Š 在利用单酶切位点或者同尾酶进行克隆连接时，为了防止载体自身环化，需要对载体进行去磷酸化处理。常用的碱性磷酸酶有Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)或者Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)。去磷酸化反应体系一般包括酶切胶回收后的载体DNA、10xSAP buffer、SAP酶和H2O，总体积20ul。大肠杆菌的转化 𐟦 在实验前，将金属浴或者恒温水箱调至42℃。然后从-80℃冰箱取出感受态细胞，于冰上化冻。接着将连接或者无缝克隆产物全部加入100ul感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰上静置15~20分钟。然后42℃热激90秒，迅速置于冰上2分钟。接着在超净台内向热激后的细菌中加入400-800ul不含抗性的LB培养液，置于恒温摇床内37℃200rpm恢复30~45分钟。离心后倒出大部分LB，留少许约100-150ulLB，在超净台吹匀沉淀菌体，将菌体悬液均匀涂布在含有对应抗性的LB平板上（取决于转化的质粒载体抗性，如Amp*或者Kan*）。将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱内培养12-16小时。最后挑取6~10个菌落进行菌落PCR鉴定，或者直接进行液体培养，提取质粒后用酶切的方法鉴定阳性克隆。保存阳性菌 𐟧Š 将鉴定出来的阳性菌进行保存，于标记好的冻存管中，每管中加入30%甘油和300新鲜细菌培养液，充分混匀后置于-80℃保存。注意事项：①如果转化的是纯质粒（非连接或者重组产物），一定要降低使用量和感受态细胞使用量、及涂布细菌量。②-80℃保存菌液时，可以在提质粒时留一点备用。希望这篇攻略能帮到你，祝你早日构建出成功的质粒！𐟚€

质粒转化实验全攻略：从准备到提取质粒的转化实验主要包括三个部分：感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和质粒DNA的提取。以下是详细的步骤：（Ⅰ）感受态细胞的制备从活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。将菌悬液按照1:100的比例转接到100ml液体培养基中，37℃振荡扩大培养，2~3小时。当培养液开始浑浊时，间断性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。将培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20分钟，0℃-4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30分钟。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率） 4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。（Ⅱ）质粒DNA的转化取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入1ul质粒DNA混匀，同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA。若解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。冰浴30分钟，离心管放到42℃保温90秒（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30分钟，可能影响转化率。然后迅速冰浴2分钟。向离心管加800ul LB液体培养基，37℃振荡培养1小时（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30分钟。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16小时，出现菌落。菌落结果：无菌落：失败或者培养条件不充分。布满菌落：呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。布满菌落：浓度太高，失败。出现菌落：符合要求。（Ⅲ）质粒DNA的提取质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。

𐟧전H5ˆ𖥤‡的魔法原理 𐟔 想要了解DH5ˆ𖥤‡的神奇原理吗？那就跟我一起来探索吧！ 𐟌𑠥œ谢„ƒ的条件下，利用钙离子作为媒介，大肠杆菌在CaCl₂低渗溶液中会膨胀成球形，细胞膜的通透性也会因此增加。 𐟒𜠨𝬥Œ–混合物中的质粒DNA与钙离子携手，形成一种坚韧的羟基-钙磷酸复合物，这个复合物能粘附在细菌细胞表面，大大提高了DNA进入细胞的几率。 𐟔堦Ž夸‹来，通过42℃的短暂热击处理，可以促进细胞对DNA复合物的吸收，让转化更加高效。 𐟌᯸ 热击后，感受态细胞被放入无抗性的液体培养基中，在37℃下孵育和复苏。这样，转入的外源DNA所携带的筛选标记等基因就能得以表达，产生抗性，比如对氨苄青霉素的抗性。 𐟎‰ 最后，将复苏后的大肠杆菌涂布在带有抗性的固体筛选培养基平板上进行筛选，就能得到我们心仪的DH5•毼 ✨ 通过这个过程，我们可以制备出转化率高达5㗱06～2㗱07转化子/质粒DNA的DH5„Ÿ受态细胞，满足各种基因克隆试验的需求。 𐟒ᠦ˜露是觉得这个过程既神奇又有趣呢？那就赶快试试吧！

PEG揭秘：酵母转化关键酵母转化过程中，PEG（聚乙二醇）以其独特的性质扮演着重要角色。𐟌 PEG是一种高分子聚合物，其分子量对酵母转化的效果有着显著影响。通常，分子量约为3000的PEG能够最有效地促进转化。 PEG在酵母转化中的主要作用包括：在高浓度的LiAc（锂乙酰）环境中保护细胞膜，减少LiAc对细胞膜结构的损伤；同时，PEG还能促进质粒更紧密地附着在酵母细胞壁上。𐟛᯸ PEG的分子量范围广泛，从300g/mol到200000g/mol不等，不同分子量的PEG在工业、医药和化妆品等领域有着各自特定的应用。𐟏�𞋥悯𜌐EG 400、PEG 600、PEG 1000等，这些数字代表的是聚合物的平均分子量。值得注意的是，50%的PEG溶液不宜进行高压灭菌，因为高压会导致PEG分子断裂，从而影响转化效率。𐟚렦�ᮧš„处理方式是过滤除菌，以确保转化过程的顺利进行。通过这些细节，我们可以看到PEG在酵母转化中的重要作用，以及其在不同领域中的广泛应用。𐟌ˆ

𐟔즞„建质粒载体的详细指南𐟧슰ŸŒˆ质粒载体的选择：首先，选择一个具备合适限制性酶切位点的质粒载体，这些位点将用于将插入片段整合到多克隆位点中。确保插入片段中不存在这些酶切位点，以避免片段被切开。 𐟌ˆ获取插入片段：DNA可以通过提取任何细胞或组织样品获得，或者通过PCR扩增。 𐟌ˆ酶切反应：扩增完成后，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切。 𐟌ˆ纯化质粒和片段：酶切后，通过电泳分离片段和载体，并使用凝胶纯化回收它们。 𐟌ˆ连接DNA片段：使用DNA连接酶将插入片段连接到质粒中。连接反应中，插入片段与载体的最佳比例为3:1，以确保少量载体自连。连接反应可以在14-25℃下孵育1小时或过夜。 𐟌ˆ转化细菌：通过热激法将连接后的质粒转化到细菌中，并将转化后的细菌涂抹在含有抗生素的琼脂板上，在37℃环境中培养过夜。由于质粒包含抗生素抗性基因，成功转化的细菌在抗生素存在下会生长形成菌落。 𐟌ˆ筛选克隆：从转化板中挑选多个单克隆，接种到含有培养基且已编号的管中，在摇床培养箱中进行扩增，并纯化质粒。 𐟌ˆ鉴定质粒：使用限制性酶切割质粒，并将酶切产物进行凝胶电泳，以检查插入片段的存在。证实转化了插入片段的质粒可用于扩大培养和测序。 𐟑颀𐟔쥜覕𔤸꨿‡程中，每个步骤都需要严格控制条件和操作规范，否则可能导致失败。只要按照这个流程认真操作，相信大家都能成功构建质粒载体！

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